Tänu CRISPR-ile ja sellega seotud geenitöötlustehnikatele on teadlased üha osavamad tegema meie DNA-s väikeseid muudatusi teatud haiguste raviks. Kuid nad töötavad endiselt välja, kuidas sisestada pikki DNA lõike inimese genoomi täpsetesse kohtadesse – see saavutus võiks laiendada redigeerimisega ravitavate seisundite valikut. Nüüd on uurimisrühm suurendanud bakterirakkudelt laenatud CRISPR-iga seotud molekulaarsete tööriistade komplekti tõhusust. Nad teatavad täna ajakirjas Science, et nad on neid tööriistu kasutanud tervete geenide suuruste DNA segmentide sisestamiseks inimese rakkudesse. Tulemuseks võib olla selle bakteriaalse süsteemi muutmine praktiliseks haiguste raviks, ütlevad teadlased, kuigi ees ootavad mõned suured tehnilised väljakutsed.
„Suurte DNA tükkide sisestamise vastu on olnud tohutu huvi,” ütleb Baylori Meditsiinikolledži immunoloog Dimitrios Wagner, kes on välja töötanud meetodeid immuunrakkude genoomide redigeerimiseks ja ei olnud uuringuga seotud. See töö „on oluline samm tehnoloogia paremaks muutmise suunas”.
Tehnika, mis võimaldab sisestada suuri DNA tükke kindlatesse kohtadesse, võiks kiirendada selliste haiguste nagu tsüstiline fibroos ja hemofiilia B ravimeetodite väljatöötamist, mis tulenevad mitmesugustest mutatsioonidest. Näiteks on tsüstilise fibroosiga seostatud üle 2000 DNA defekti. Kui teadlased suudaksid sisestada terve korrigeeritud geeni, saaksid nad luua ühe ravi paljude mutatsioonide jaoks. Nad ei peaks välja töötama, testima ega saama regulatiivset heakskiitu iga genoomi tõrke jaoks kohandatud ravile, nagu täna varem teatatud isikupärastatud lahendus ensüümihäirega lapsele. Geeni sisestamise tehnoloogiad võivad võimaldada teadlastel ka kimäärseid antigeeni retseptor-T-rakke, geneetiliselt muundatud immuunrakke, mis võitlevad vähiga, täiustada.
Väljakutse on olnud selles, kuidas seda teha. Geeniteraapia tugineb sageli taltsutatud viirustele, mis kannavad täissuuruses geene rakkudesse. Kuid lähenemisviis on ebatäpne. Lisatud geenid maanduvad genoomis juhuslikesse kohtadesse või ei pruugi üldse siseneda. Seevastu täpsus on selliste geenitöötlustehnikate tunnusjoon nagu CRISPR – mis on heaks kiidetud sirprakulise aneemia raviks ja mida testitakse mitmete teiste haiguste vastu – ning aluste redigeerimine, CRISPR-i kõrvalsaadus, mis vahetab välja probleemsed DNA alused ja on samuti kliinilistes uuringutes. Sellised tehnikad toimivad hästi alla 200 aluspaari suuruste muudatuste korral, kuid inimese geenid on tavaliselt tuhandete aluspaari pikkused. Traditsiooniliste CRISPR-süsteemide teine piirang on see, et need jätavad redigeerimiskohas mõlemasse DNA ahelasse katkestusi, mis võib põhjustada kahjulikke mõjusid, nagu geneetilise materjali kadu või juurdetulek.
Uus töö tugineb hoopis ensüümidele, mida nimetatakse CRISPR-seotud transposaasideks ehk CAST-ideks ja mis suudavad DNA-d sisestada ilma neid kaheahelalisi murde tekitamata. Bakterirakkudes aitavad CAST-id parasiitsetel DNA järjestustel, mida tuntakse transposoonidena, genoomis ühest kohast teise hüpata. Ensüümides olev juht-RNA ahel määrab täpselt, kuhu nomaadsed järjestused sisestada.
Varasemad uuringud on kindlaks teinud, et CAST-id on peaaegu 100% efektiivsed DNA tükkide kiirel sisestamisel bakteriaalsete genoomide sihtkohtadesse. Kuid inimrakkudes on need jäänud alla ootuste. Näiteks eelmisel aastal teatas Columbia ülikooli biokeemik Samuel Sternberg ja tema kolleegid, et protsessi efektiivsus oli vaid umbes 0,1%.
Lähenemisviisi täiustamiseks ühendas Sternbergi labor jõud meeskonnaga, mida juhtis genoomi redigeerimise virtuoos David Liu, Harvardi ülikooli ja Broadi instituudi keemiabioloog. Nii keerulise süsteemi nagu CAST täiustuste kavandamine on keeruline, seega pöördus meeskond Liu laboris välja töötatud kunstliku evolutsioonisüsteemi poole, mis sisaldab baktereid ja nende viirusparasiite. Teadlased sisestasid viiruste genoomidesse mõnede CAST-valkude järjestused. Patogeenide paljunemiseks pidid nende CAST-id manipuleerima bakterite DNA-ga, aktiveerides mikroobides geeni, mis võimaldab viiruse replikatsiooni.
Viiruste juhuslik muteerimine andis looduslikule valikule materjali tüvede arendamiseks, mille CAST-valgud olid peremeesorganismi DNA-s nihete ja insertsioonide tegemisel kõige tõhusamad. Liu sõnul kiirendab see lähenemisviis loomuliku evolutsiooni kiirust 1000 korda. „Seda me kasutasime probleemi lahendamiseks.”
Pärast seda, kui CAST-i komponentidel lasti areneda sadade viiruspõlvkondade vältel, täpsustasid teadlased neid ja seejärel testisid süsteemi mitmesugustes inimese rakuliinides. Katsed näitasid, et uuendatud süsteem töötas umbes 200 korda paremini kui originaal, efektiivsusega, mis langes tavaliselt 10% ja 30% vahele. Teadlased näitasid ka inimese rakkudes, et uuendatud CAST-id võivad teha kliiniliselt olulisi muutusi, näiteks sisestada vere hüübimist soodustava valgu IX faktori geeni, mis on hemofiilia B puhul vigane.
See artikkel pakub esimest tõestust selle kohta, et CAST-id suudavad sisestada suuri DNA tükke „a „inimrakkudes märkimisväärsel tasemel“ ja see „seab aluse lähenemisviisi tõhususele“, ütleb molekulaargeneetik Shondra Miller St. Jude'i lasteuuringute haiglast. Stanley Qi, Stanfordi ülikooli bioinsener, kiitis meeskonna „muljetavaldavat tööd võtmevalkude suunatud evolutsioonil“.
Uuring „on inseneriteaduse vallas meistriteos,“ ütleb geeniteraapia uurija Luigi Naldini San Raffaele'i ülikooli meditsiinikoolist, kuid „kliinilise translatsioonini on veel arenguruumi“. CAST-id on suhteliselt suured, mis võib raskendada nende viimist patsiendi rakkudesse. CAST-ide viimine õigetesse kudedesse kehas võib samuti olla keeruline. Ja Liu märgib, et teadlastel võib tekkida vajadus võidelda rakkude loomuliku kaitsega patogeenide vastu. „Paljud rakud on vastu sellele, et neisse sisestatakse suuri DNA tükke. Nad arvavad, et on viiruse rünnaku all.“
Teadlased arendavad inimese genoomi suurte DNA-tükkide lisamiseks teisi meetodeid, sealhulgas Liu ja tema kolleegide 2021. aastal avalikustatud PASSIGE-tehnikat, mis tugineb CAST-ide asemel DNA-d vahetavatele ensüümidele, mida nimetatakse rekombinaasideks. „On veel liiga vara öelda, milline tehnoloogia on parim,“ ütleb Sternberg. Kuid nüüd on teadlastel „võimalus neid omavahel võrrelda“.
Lisateave: https://www.science.org/content/article/jumping-gene-enzyme-can-make-big-precise-changes-human-dna
